LC-MS/MS 기반 단백체학에서 데이터 획득(Data Acquisition) 방식의 차이와 DIA Deconvolution의 핵심 원리

현대 LC-MS/MS 기반 proteomics에서는 수천~수만 개의 peptide를 동시에 분석해야 합니다.

하지만 질량분석기는 모든 precursor ion을 동시에 완벽하게 fragmentation할 수 없기 때문에, 어떤 precursor를 어떤 방식으로 선택하고 fragmentation할 것인지가 매우 중요합니다.

이러한 MS/MS 데이터 획득 전략(acquisition strategy)은 proteomics 성능 자체를 결정합니다.

현재 proteomics 분야에서는 크게 두 가지 acquisition 방식이 사용됩니다.

• DDA (Data-Dependent Acquisition)
• DIA (Data-Independent Acquisition)

초기 shotgun proteomics는 대부분 DDA 기반으로 발전했지만, 최근에는 DIA가 proteomics workflow의 핵심 기술로 빠르게 확산되고 있습니다.

특히 DIA는:

• 높은 reproducibility
• deep proteome coverage
• 강력한 quantitative capability

를 제공하는 대신,

• 매우 복잡한 chimeric MS/MS spectrum
• 정교한 spectral deconvolution
• AI 기반 peptide identification

을 필요로 합니다.

이번 글에서는 DDA와 DIA의 acquisition 원리, 데이터 구조의 차이, 장단점, 그리고 DIA에서 왜 고해상도 질량분석기와 복잡한 deconvolution 알고리즘이 필수적인지 자세히 설명하겠습니다.

Comparison of DDA (Data-Dependent Acquisition) and DIA (Data-Independent Acquisition) workflows in LC-MS/MS proteomics. The figure illustrates precursor selection, fragmentation mechanisms, chimeric spectrum generation, and the role of chromatographic co-elution and spectral deconvolution in DIA analysis.

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Proteomics에서 MS/MS Acquisition이 중요한 이유

LC-MS/MS 기반 proteomics에서는 peptide를 직접 읽는 것이 아니라:

• precursor ion 검출
• precursor fragmentation
• fragment pattern 분석

을 통해 peptide를 추론합니다.

즉 proteomics identification의 핵심은:

• 어떤 precursor를 선택하는가
• 어떤 fragment spectrum을 얻는가
• fragment를 얼마나 정확하게 분리할 수 있는가

입니다.

이 acquisition 전략이 바로:

• DDA
• DIA

입니다.

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Data-Dependent Acquisition (DDA)란 무엇인가?

DDA(Data-Dependent Acquisition)는 가장 전통적인 proteomics acquisition 방식입니다.

DDA에서는:

• MS1 full scan 수행
• intensity가 높은 precursor 자동 선택
• 선택된 precursor를 fragmentation
• MS/MS spectrum 획득

순서로 분석이 진행됩니다.

즉 acquisition이 실제 데이터(signal intensity)에 의존합니다.

그래서 이름이:

• Data-Dependent Acquisition

입니다.

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DDA Workflow

일반적인 workflow는 다음과 같습니다.

• MS1 Full Scan
• Top-N precursor selection
• Isolation
• CID/HCD/ETD fragmentation
• MS/MS acquisition

예를 들어 Orbitrap 장비에서는:

• MS1에서 intensity가 가장 높은 peptide 20개 선택
• sequential fragmentation 수행
• 각각의 MS/MS spectrum 생성

과 같은 방식이 사용됩니다.

이를 흔히:

• Top-N DDA

라고 부릅니다.

예:

• Top10
• Top20
• Top40

등.

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DDA의 핵심 특징

DDA는 기본적으로:

• signal intensity 기반 precursor selection

방식입니다.

즉 abundance가 높은 peptide가 우선적으로 fragmentation됩니다.

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DDA의 장점

1. 상대적으로 깨끗한 MS/MS Spectrum

하나의 precursor를 isolation한 후 fragmentation하기 때문에:

• fragment assignment가 명확
• spectral interpretation이 비교적 쉬움
• database search가 안정적

입니다.

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2. Spectral Library 구축에 유리

DDA는 clean spectrum을 제공하므로:

• peptide spectral library
• PTM spectral database

구축에 매우 적합합니다.

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3. Traditional Proteomics Workflow와 호환성 우수

다음과 같은 classical search engine과 잘 맞습니다.

• Mascot
• Sequest
• Andromeda
• PEAKS

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4. PTM 분석에 강점

복잡한 PTM fragmentation 해석에서는:

• cleaner spectrum
• 명확한 fragment assignment

가 유리한 경우가 많습니다.

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DDA의 한계점

하지만 DDA는 매우 중요한 문제를 가지고 있습니다.

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1. Stochastic Sampling 문제

DDA는:

• intensity 기반 precursor selection

을 수행하기 때문에 run마다 선택되는 precursor가 달라질 수 있습니다.

이를:

• stochastic sampling

이라고 합니다.

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2. Missing Values 문제

예를 들어:

• Run 1에서는 peptide A 선택
• Run 2에서는 peptide A 미선택

상황이 발생할 수 있습니다.

특히:

• low abundance peptide
• co-eluting peptide

에서 자주 발생합니다.

이는 quantitative proteomics에서 큰 문제입니다.

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3. Dynamic Range 한계

복잡한 biological sample에서는:

• high abundance peptide dominance
• low abundance peptide suppression

문제가 발생합니다.

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4. Run-to-Run Reproducibility 제한

DDA는 acquisition 자체가 dynamic하기 때문에:

• replicate 간 consistency
• quantitative reproducibility

가 제한될 수 있습니다.

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DIA(Data-Independent Acquisition)란 무엇인가?

DIA(Data-Independent Acquisition)는 DDA의 한계를 극복하기 위해 등장한 acquisition 방식입니다.

핵심 개념은 매우 다릅니다.

DIA에서는:

• 특정 precursor만 선택하지 않고
• 넓은 m/z window 전체를 fragmentation

합니다.

즉 acquisition이 precursor intensity에 의존하지 않습니다.

그래서:

• Data-Independent Acquisition

이라고 부릅니다.

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DIA Workflow

예를 들어 다음과 같은 isolation window를 sequentially fragmentation합니다.

• 400–425 m/z
• 425–450 m/z
• 450–475 m/z
• 475–500 m/z

각 window 내부의 모든 precursor가 동시에 fragmentation됩니다.

즉 DIA는:

• 가능한 모든 peptide 정보를 빠짐없이 기록

하려는 전략입니다.

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DIA의 핵심 특징

DIA는 기본적으로:

• 모든 precursor fragmentation을 최대한 보존

하려는 acquisition 방식입니다.

즉:

• comprehensive acquisition
• reproducibility 향상
• quantitative stability 증가

에 강점이 있습니다.

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DIA의 장점

1. 높은 Reproducibility

모든 precursor window를 반복적으로 측정하기 때문에:

• run-to-run variability 감소
• missing values 감소

효과가 큽니다.

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2. Quantitative Proteomics에 매우 강함

특히:

• large cohort study
• clinical proteomics
• biomarker discovery

에서 강력한 quantitative stability를 제공합니다.

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3. Low-Abundance Peptide 검출 증가

DDA에서는 선택되지 못했던 peptide도:

• DIA에서는 fragmentation 가능성 증가

효과가 있습니다.

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4. Deep Proteome Coverage

더 많은 peptide 정보를 지속적으로 획득할 수 있습니다.

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DIA의 가장 큰 문제: 데이터 복잡도

하지만 DIA에는 매우 큰 문제가 존재합니다.

바로:

• 동시에 너무 많은 precursor가 fragmentation된다는 점

입니다.

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Co-Fragmentation 문제

예를 들어:

425–450 m/z window 내부에:

• peptide A
• peptide B
• peptide C

가 동시에 존재할 수 있습니다.

DIA에서는 이들을:

• 동시에 fragmentation

합니다.

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Chimeric Spectrum이란?

결과적으로 하나의 MS/MS spectrum 안에:

• 여러 peptide fragment
• 여러 charge state
• 여러 isotope pattern

이 혼합됩니다.

이를:

• Chimeric Spectrum

이라고 합니다.

즉 DIA 데이터는 본질적으로:

• 혼합 fragment spectrum

입니다.

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왜 DIA에서 Deconvolution이 중요한가?

DIA의 핵심 난제는:

• fragment가 어떤 precursor에서 유래했는지 분리하는 것

입니다.

즉:

• signal disentangling
• fragment assignment
• chromatographic correlation

이 필수적입니다.

이를 위해 사용되는 것이:

• Spectral Deconvolution

알고리즘입니다.

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DIA Deconvolution의 핵심 원리

현대 DIA software는 여러 정보를 동시에 사용하여 혼합 spectrum을 분리합니다.

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1. Accurate Mass

고정밀 질량 정확도(ppm-level mass accuracy)를 사용합니다.

예:

• 5 ppm
• sub-ppm accuracy

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2. Retention Time (RT)

동일 peptide에서 유래한 fragment는:

• 동일한 chromatographic retention time profile

을 가집니다.

즉:

• 같은 시간에 증가하고
• 같은 시간에 감소합니다.

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3. Fragment Co-Elution

동일 precursor에서 유래한 fragment ion들은 아무리 fragmentation되어도:

• LC column에서 동일한 retention time profile
• 동일한 chromatographic apex
• 유사한 peak shape

를 유지합니다.

따라서 DIA software는:

• XIC(Extracted Ion Chromatogram)의 상관계수(correlation coefficient)

를 계산하여:

• 서로 함께 elution되는 fragment들을 grouping하고
• 혼합 spectrum을 disentangling합니다.

이 chromatographic correlation은 DIA deconvolution의 핵심 원리 중 하나입니다.

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4. Spectral Library Matching

기존 peptide fragmentation library와 비교하여:

• peptide identity
• fragment consistency

를 확인합니다.

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5. Isotope Pattern Consistency

동위원소 패턴의 consistency를 이용해:

• false assignment 감소
• fragment confidence 증가

를 수행합니다.

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DIA에서 고해상도 질량분석기(HRMS)가 중요한 이유

DIA는 데이터 복잡도가 매우 높기 때문에:

• 높은 mass accuracy
• 높은 resolving power

가 필수적입니다.

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Orbitrap/QTOF가 중요한 이유

고해상도 장비는:

• narrow mass tolerance
• isotope separation
• fragment discrimination
• interference reduction

을 가능하게 합니다.

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Resolution이 낮으면 발생하는 문제

Low-resolution MS에서는:

• fragment overlap 증가
• false assignment 증가
• co-isolation interference 증가

문제가 심각해집니다.

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DIA와 AI 기반 알고리즘

최근 DIA 발전의 핵심은:

• software algorithm의 발전

입니다.

특히:

• AI
• machine learning
• neural network scoring

기술이 DIA proteomics에서 매우 중요해지고 있습니다.

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대표적인 DIA Software

DIA-NN

딥러닝 기반 DIA 분석 플랫폼.

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Spectronaut

대표적인 commercial DIA software.

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OpenSWATH

Open-source DIA workflow.

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Skyline

Targeted proteomics 및 DIA 지원.

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EncyclopeDIA

Library 기반 DIA analysis software.

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DIA 분석 Workflow

실제 DIA workflow는 일반적으로 다음 단계를 거칩니다.

• Raw DIA Data
• Signal Extraction
• Spectral Deconvolution
• Library Matching
• FDR Filtering
• Quantification

즉 modern DIA proteomics에서는:

• software 자체가 proteomics 성능의 핵심

이 되었습니다.

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DDA vs DIA 비교표

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DIA가 Proteomics 패러다임을 바꾸는 이유

최근 proteomics는:

• 가능한 많은 peptide를 안정적으로 정량

하는 방향으로 발전하고 있습니다.

이 목표에 DIA는 매우 적합합니다.

특히 다음 분야에서 DIA adoption이 빠르게 증가하고 있습니다.

• biomarker discovery
• clinical proteomics
• cohort analysis
• longitudinal proteomics
• systems biology

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Practical Troubleshooting: DIA 분석 시 주의할 점

1. Isolation Window Size

window가 너무 넓으면:

• co-fragmentation 증가
• chimeric complexity 증가

문제가 발생합니다.

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2. Spectral Library 품질

library 품질이 낮으면:

• false identification
• incorrect matching

이 증가합니다.

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3. Retention Time Alignment

RT drift는 DIA 성능에 큰 영향을 줍니다.

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4. Mass Calibration

ppm error 증가 시:

• deconvolution 성능 저하
• peptide assignment 오류

가 증가합니다.

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5. Chromatographic Separation

LC separation quality가 낮으면:

• co-elution 증가
• spectral complexity 증가

문제가 심각해집니다.

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Conclusion

DDA와 DIA는 단순 acquisition 차이를 넘어:

• 현대 proteomics 데이터 해석 철학의 차이

를 보여줍니다.

DDA는:

• cleaner spectrum
• precursor 중심 acquisition

에 강점이 있습니다.

반면 DIA는:

• comprehensive acquisition
• 높은 reproducibility
• 강력한 quantitative capability

를 제공합니다.

하지만 DIA는 본질적으로:

• 복잡한 혼합 fragment spectrum

을 생성하기 때문에:

• 고해상도 질량분석기(HRMS)
• chromatographic correlation
• spectral deconvolution
• AI 기반 peptide identification

이 필수적입니다.

즉 modern proteomics에서는:

• instrument 성능만큼 software와 data interpretation이 중요 해지고 있습니다.

Spectra and workflow illustrations shown in this article were generated or adapted for educational purposes using Willy’s LCMS concepts and proteomics interpretation workflows.

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