How to Read MS/MS Spectrum Step-by-Step (Practical Guide)

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LC-MS/MS 스펙트럼을 해석하는 실제 방법

Proteomics LC-MS/MS 분석에서 얻어지는 MS/MS 스펙트럼에는 수십에서 수백 개의 fragment ion 피크가 존재합니다.
그러나 이 피크들은 무작위로 나타나는 것이 아니라 peptide backbone fragmentation에 의해 생성된 구조적인 패턴을 가지고 있습니다.

따라서 MS/MS 데이터를 해석할 때는 단순히 피크를 보는 것이 아니라 체계적인 순서로 접근하는 것이 중요합니다.

아래는 실제 proteomics 분석에서 사용하는 MS/MS 스펙트럼 해석의 기본 단계입니다.


Step 1 — Precursor 정보 확인

MS/MS 해석의 출발점은 precursor ion 정보입니다.

확인해야 할 주요 정보는 다음과 같습니다.

Parameter의미
Precursor m/zMS1에서 선택된 이온
Charge stateprecursor 전하 상태
Retention timeLC 분리에서의 elution 위치

특히 precursor charge는 매우 중요합니다.

charge가 z일 때 fragment ion의 isotope spacing은 다음과 같습니다.

Δm/z = 1 / z

예를 들어

z = 2 → isotope spacing ≈ 0.5 Da
z = 3 → isotope spacing ≈ 0.33 Da

precursor charge가 잘못 설정되면 peptide mass 계산이 틀어질 수 있습니다.


Step 2 — MS/MS 스펙트럼의 주요 피크 확인

MS/MS 스펙트럼의 기본 구조는 다음과 같습니다.

y축 : Intensity (signal strength)
x축 : m/z (mass-to-charge ratio)

각 피크는 하나의 fragment ion을 의미합니다.

높은 intensity 피크는 보통 다음과 같은 이온일 가능성이 높습니다.

  • y-ions 
  • b-ions 
  • neutral loss fragments

그러나 가장 강한 피크가 항상 중요한 것은 아닙니다.

MS/MS 해석에서 더 중요한 것은

fragment ion series 즉 연속적인 fragment 패턴입니다.

Step 3 — y-ion Ladder 찾기

Proteomics MS/MS 스펙트럼에서 가장 중요한 패턴 중 하나는 y-ion ladder입니다.
y-ion ladder는 다음과 같이 나타납니다.
Intensity
|
|           y6
|        y5
|     y4
|  y3
| y2
|
+--------------------------------
                 m/z

이러한 연속적인 fragment series는 peptide backbone cleavage를 직접 반영하기 때문에 peptide sequence 해석에 매우 중요한 정보를 제공합니다.

특히 tryptic peptide에서는 C-terminal Lys 또는 Arg 때문에 y-ion이 안정하게 생성되는 경우가 많습니다.


Step 4 — Fragment Mass Difference 계산

연속적인 fragment ion이 확인되면 다음 단계는 질량 차이를 계산하는 것입니다.
두 fragment ion 사이의 질량 차이는 특정 amino acid residue 질량과 일치합니다.

예

Δm/zAmino Acid
71Alanine
99Valine
113Leucine / Isoleucine
147Phenylalanine

예를 들어

y5 − y4 = 113 Da

라면 해당 위치에는 Leucine 또는 Isoleucine 이 존재할 가능성이 있습니다. 이러한 질량 차이를 이용하여 peptide sequence tag를 만들 수 있습니다.


Step 5 — Neutral Loss 확인

MS/MS 스펙트럼에서는 종종 neutral loss fragment가 관찰됩니다.

대표적인 neutral loss는 다음과 같습니다.

Neutral LossMass shift
H₂O−18.0106
NH₃−17.0265
H₃PO₄−97.9769

예를 들어

y5 − H2O
b4 − NH3
와 같은 fragment가 나타날 수 있습니다.
Neutral loss는 특정 residue 또는 PTM 존재를 암시할 수 있습니다.

예

ResidueNeutral Loss
Ser / ThrH₂O
Lys / ArgNH₃
PhosphorylationH₃PO₄

Step 6 — Sequence Tag 생성

fragment ion series와 질량 차이를 이용하면 sequence tag를 만들 수 있습니다.

예

Δm/z = 147 → F
Δm/z = 113 → L/I
Δm/z = 71 → A

이 경우

FLA

와 같은 peptide sequence tag가 생성됩니다.

Sequence tag는 database search 결과를 검증하거나 de novo sequencing에서 매우 중요한 역할을 합니다.


Step 7 — Database Search 결과와 비교

Proteomics 분석에서는 일반적으로 MS/MS 스펙트럼을 database search 엔진과 비교하여 peptide identification을 수행합니다.

대표적인 search engine

  • Mascot 
  • Sequest 
  • MS-GF+ 
  • Andromeda

search 결과에서 제안된 peptide sequence는 theoretical fragment ion을 생성하며, 이 fragment들이 실제 MS/MS 스펙트럼과 얼마나 잘 일치하는지를 평가합니다.

특히 다음 fragment series가 잘 맞으면 identification 신뢰도가 높아집니다.

y-ion ladder
b-ion ladder
neutral loss fragments

Practical Summary

MS/MS 스펙트럼 해석은 다음 순서로 접근하는 것이 효과적입니다.

1) precursor ion 확인
2) 주요 fragment ion 피크 확인
3) y-ion ladder 탐색
4) fragment mass difference 계산
5) neutral loss 패턴 확인
6) sequence tag 생성
7) database search 결과 검증

b ion / y ion

(Willys LCMS 에서 생성한 MGF data Precheck 차트 입니다)

이렇게 단계적 접근을 통하여 복잡한 MS/MS 스펙트럼에서도 peptide sequence를 체계적으로 해석할 수 있습니다.

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