LC-MS/MS 스펙트럼 해석

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MS1과 MS2를 이해하는 전체 지도(Map)

LC-MS/MS 데이터를 처음 마주하면 수많은 피크와 숫자들이 복잡하게 보입니다.
그러나 스펙트럼은 무작위 신호가 아니라, 명확한 물리적 원리에 따라 생성된 정보의 집합입니다.

LC-MS/MS 해석을 시작하기 전에 반드시 이해해야 할 핵심 개념들을 정리합니다:

  • MS1과 MS2의 차이

  • Precursor와 Fragment의 관계

  • m/z의 의미

  • Intensity 해석

  • Charge 개념

  • Resolution(분해능)의 역할

  • LC-MS 스펙트럼이 실제로 포함하고 있는 정보

MS1과 MS2

LC-MS/MS는 기본적으로 두 단계의 질량 분석으로 구성됩니다.

MS1 (Full Scan)

MS1은 이온화된 모든 이온을 스캔하여
현재 시점에서 존재하는 분자들의 m/z 분포를 보여줍니다.

한 문장으로 정리하면:

MS1은 “무엇이 존재하는가”를 보여줍니다.

여기서 우리는 다음을 확인합니다:

MS2 (Tandem MS)

MS2에서는 MS1에서 선택한 특정 이온(Precursor)을 콜리젼 셀에서 분해하여 생성된 Fragment 이온들을 측정합니다.

즉, MS2는 “그 분자가 어떻게 생겼는가”를 보여줍니다.

MS1이 전체 지도라면, MS2는 특정 지점의 확대 분석이라고 볼 수 있습니다.


Precursor와 Fragment의 관계

Precursor ion은 MS1에서 선택된 이온입니다.
이 이온이 충돌 에너지를 받아 분해되면 fragment ion이 생성됩니다.

관계는 다음과 같습니다:

Precursor → 충돌 → Fragment 1 + Fragment 2 + …

Fragment는 구조의 일부를 반영합니다.

  • 펩타이드의 경우: b ion, y ion

  • 소분자의 경우: 중성 손실(Neutral Loss), 특정 결합 절단

따라서 MS2는 단순한 숫자 나열이 아니라 구조 정보를 담고 있는 분해 패턴입니다.


m/z의 의미

질량분석기는 “질량”을 직접 측정하지 않습니다.
측정하는 것은 m/z (mass-to-charge ratio) 입니다.

m/z = 질량 / 전하수

예를 들어:

  • 질량 1000 Da, 전하 +1 → m/z 1000

  • 질량 1000 Da, 전하 +2 → m/z 500

따라서 동일한 분자라도 전하 상태에 따라 다른 위치에 피크가 나타날 수 있습니다.

m/z를 정확하게 이해하지 않으면 실제 분자 질량을 잘못 해석할 위험이 있습니다.


Charge

ESI에서는 특히 다중전하 이온이 흔합니다.

단백질이나 펩타이드는:

  • +1, +2. +3, +4 … 와 같은 여러 전하 상태로 존재할 수 있습니다.

Charge를 계산하면 실제 중성 분자 질량(Neutral Mass)을 환산할 수 있습니다.

이 단계는 Precursor 해석 에서 가장 중요한 절차 중 하나입니다.


Intensity

스펙트럼에서 피크의 높이는 Intensity를 의미합니다. 하지만 intensity는 단순 농도만을 반영하지 않습니다.

영향 요소:

  • 이온화 효율 / 기기 감도 / 충돌 에너지 / 분해 안정성

MS1에서 높은 intensity는 abundance를 시사할 수 있지만, MS2에서는 fragment 안정성과도 관련됩니다.

따라서 intensity는 “정량 정보”이면서 동시에 “구조 안정성 정보”이기도 합니다.


Adduct(애덕트)

LC-MS, 특히 ESI 조건에서는 분자가 단순히 H⁺만 결합하는 것이 아닙니다.
용매, 버퍼, 염 이온과 상호작용하여 다양한 Adduct ion(부가 이온) 을 형성할 수 있습니다.

대표적인 양이온 모드 Adduct는 다음과 같습니다:

  • [M+H]⁺ (Protonated ion), [M+Na]⁺ (Sodium adduct), [M+K]⁺ (Potassium adduct), [M+NH₄]⁺ (Ammonium adduct) ..

음이온 모드에서는:

  • [M−H]⁻, [M+Cl]⁻, [M+FA−H]⁻ (Formate adduct) ..

와 같은 형태가 관찰됩니다.

Adduct의 형성은 다음에 영향을 줍니다:

  • 관측되는 m/z 값 변화

  • Isotope pattern 변화

  • Fragmentation 경향

  • 정량 정확도

예를 들어, 분자량이 180 Da인 화합물은

  • [M+H]⁺ → m/z 181

  • [M+Na]⁺ → m/z 203

  • [M+K]⁺ → m/z 219

처럼 전혀 다른 위치에 나타날 수 있습니다.

따라서 Precursor 해석 시 가장 먼저 확인해야 할 것은 “이 피크가 어떤 Adduct인가?” 입니다.

Adduct를 잘못 가정하면 분자식 계산이 완전히 틀어질 수 있습니다.


Resolution (분해능)

Resolution과 FWHM (Full Width at Half Maximum)

Resolution(분해능)은 두 개의 인접한 m/z 피크를 구분할 수 있는 능력을 의미합니다.

질량분석에서 Resolution은 일반적으로 다음과 같이 정의됩니다:

Resolution=mΔmResolution = \frac{m}{\Delta m}

여기서
m = 피크의 중심 m/z 값
Δm = 피크 폭 (일반적으로 FWHM 기준)

FWHM (Full Width at Half Maximum)

FWHM은 피크 높이의 50% 지점에서의 폭을 의미합니다.

즉,

  • 피크의 최대 높이를 찾고 

  • 그 높이의 절반 지점에서

  • 좌우 폭을 측정한 값이 Δm 입니다.

예를 들어:

m/z = 400에서
FWHM = 0.01 이라면

Resolution=4000.01=40,000Resolution = \frac{400}{0.01} = 40,000

이 장비의 분해능은 40,000 (at m/z 400) 입니다.


Resolution이 중요한 이유

Resolution이 낮으면:

  • 동위원소 피크 분리 불가

  • 근접한 분자식 후보 구분 어려움

  • 정확 질량 기반 분자식 제안 정확도 저하

Resolution이 높으면:

  • ¹³C, ¹⁵N 기여 분리 가능

  • Isotopic fine structure 확인 가능

  • ppm 단위 질량 오차 관리 가능

특히 고해상도(Orbitrap, FT-ICR 등)에서는 Resolution 설정값에 따라 스펙트럼 해석 난이도가 크게 달라집니다.


Example: C₃₀H₄₀N₄O₆ , 

C30H40N4O6 의 Resolution 비교

Resolution에 따른 Isotopic Pattern 비교

위 그림은 동일한 분자식 C₃₀H₄₀N₄O₆에 대해 해상도를 다르게 설정하여 시뮬레이션한 동위원소 패턴입니다. (차트는 Willy's LCMS 프로그램으로 시물레이션 하였습니다.)

왼쪽부터:

  • R = 1000

  • R = 500,000

  • R = 500,000 (M+1 영역 확대)



해상도 (Resolution)관찰 가능한 정보특징 및 효과비교
1000 (저해상도, Triple Quadrupole 수준)동위원소 cluster 존재 여부동위원소 봉우리 넓게 퍼져 보이며 M, M+1, M+2 구분 가능
피크 폭이 넓어 내부 구조 관찰 불가
동위원소 미세 구조(fine structure)는 하나의 봉우리로 합쳐짐		동위원소 봉우리 존재 확인에 그침
약 25,000 수준날카로운 봉우리 및 향상된 질량 정확도피크 폭 급격히 좁아지고 피크 형태는 날카로움
질량 정확도 ppm 수준으로 향상		전체 cluster 피크 개수 동일하지만 피크 형태·정확도 다름
500,000 (고해상도, FT-ICR 수준)Isotopic fine structure 분리 가능각 동위원소 봉우리가 매우 날카로우며 이론적 stick spectrum 형태와 유사
M+1 영역 내부의 ¹³C, ¹⁵N 기여 등 미세 질량 차이 분리 가능		¹³C 개수 추정 정확도 향상
¹⁵N 기여 구분 가능
분자식 후보 검증 정확도 상승
동위원소 기반 분자식 필터링 가능

해상도가 질량분석에서 중요한 이유는 동위원소 봉우리의 단순 관찰을 넘어서, 분자식 신뢰도를 결정하는 미세 동위원소 구조까지 확인 가능하게 하기 때문입니다. 저해상도는 단순 존재 확인에 그치지만, 고해상도에서는 동위원소의 다양한 조합별 미세 구조 분리가 가능해 정확한 원소 조성 분석과 분자식 검증에 크게 기여합니다. 이는 정확한 화학식 해석 및 후보 물질 필터링에 필수적인 요소입니다.


LC-MS 스펙트럼이 포함하고 있는 정보

LC-MS 데이터에는 단순 m/z 값 이상의 정보가 포함되어 있습니다.

  • Retention time (LC 분리 정보)

  • Precursor m/z, Charge state, Isotope pattern

  • Fragment distribution, Intensity profile

즉, LC-MS 스펙트럼은 질량 정보 + 구조 정보 + 분리 정보 가 결합된 다차원 데이터입니다.


해석의 기본 순서

LC-MS/MS 해석은 다음 순서로 접근하는 것이 효율적입니다.

  • Precursor m/z 확인 
  •  Charge 계산  
  • Neutral mass 환산 
  • Isotope pattern 검증 
  • Fragment 패턴 해석

이 순서를 체계화하여 데이터 해석이 논리로 정리됩니다.



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