Peptide Fragmentation Rules Cheat Sheet

LC-MS/MS Proteomics 데이터 해석을 위한 핵심 규칙

LC-MS/MS 기반 proteomics 분석에서 peptide identification의 핵심은 MS/MS fragmentation 패턴 해석입니다.
펩타이드가 collision cell에서 분해되면 특정 규칙에 따라 fragment ion이 생성되며, 이러한 패턴을 이해하면 MS/MS spectrum을 훨씬 빠르고 정확하게 해석할 수 있습니다.

이 글에서는 proteomics 분석에서 자주 사용되는 peptide fragmentation 규칙을 quick reference 형태로 정리합니다.

---

기본 Fragment Ion 종류

펩타이드 backbone이 분해되면 다음 fragment ion이 생성됩니다.

Proteomics 분석에서 가장 중요한 fragment는 다음 두 가지입니다.

b-ion
y-ion

Peptide fragmentation (b-ion & y-ion) formation diagram. 펩타이드 백본의 아미드 결합 절단을 통한 b-이온(N-말단) 및 y-이온(C-말단) 생성 원리 구조도.

Peptide Fragmentation 기본 규칙

Rule 1 — Backbone cleavage

CID/HCD fragmentation에서는 peptide backbone의 amide bond가 절단됩니다.

—CO—NH—

이 결합이 끊어지면 다음 fragment가 생성됩니다.

b-ion (N-terminal)
y-ion (C-terminal)

---

Rule 2 — y-ion이 더 강하다

대부분의 proteomics MS/MS spectrum에서는 y-ion intensity가 더 강합니다.

이유

• proton stabilization

• C-terminal stability

• fragment survival probability

따라서 스펙트럼 해석 시 y-ion ladder를 먼저 찾는 것이 일반적입니다.

---

Rule 3 — Charge state 영향

ESI ionization에서는 peptide가 다중전하 상태로 존재합니다.

[M+H]+
[M+2H]2+
[M+3H]3+

Charge state가 높을수록 fragmentation efficiency가 증가합니다.

특히

z ≥ 2

일 때 fragmentation 패턴이 더 풍부해집니다.

---

Fragment Mass Difference

Peptide sequencing에서 가장 중요한 것은 fragment ion 사이의 질량 차이입니다.

각 amino acid는 고유한 질량을 가지고 있기 때문에 fragment mass difference를 계산하면 아미노산을 확인할 수 있습니다.

예

예시

y3 − y2 = 129.042

→ Glutamic acid 가능성

Neutral Loss 패턴

Proteomics MS/MS에서는 특정 neutral loss가 자주 나타납니다.

예

y7
y7 − H2O
y7 − NH3

이러한 패턴은 peptide composition 추정에 도움이 됩니다.

Immonium Ion

MS/MS spectrum의 low m/z 영역에는 immonium ion이 나타날 수 있습니다.

Immonium ion은 아미노산 잔기의 α-아미노와 α-탄소 간 결합이 절단되어 생성되는 소형 fragment 이온으로, peptide MS/MS 분석 시 low m/z 영역에서 관찰됩니다. 개별 아미노산 고유의 m/z 값을 가지기 때문에 아미노산 존재 여부를 신속하게 확인하는 데 필수적인 진단 이온입니다.

이 fragment는 특정 아미노산 존재를 알려주는 diagnostic ion입니다.

주요 Immonium Ion m/z 값 

활용 및 한계

• immonium ion은 펩타이드 조성에서 특정 아미노산의 사용 여부를 빠르게 알 수 있도록 도와주며, 복잡한 혼합물에서도 진단이 가능합니다.
• 하지만 단독으로는 서열을 결정하지 못하며, b-, y-ion과 같은 시리즈 분석과 결합해야 정확한 식별이 가능합니다.
• 특히 동질이성질체인 Leu/Ile는 immonium ion, 질량 등에서 동일해 구분하려면 추가 방법이나 참고 데이터가 요구됩니다.

PTM Fragmentation 특징

PTM이 존재하는 peptide는 특이한 fragmentation 패턴을 보일 수 있습니다.

예

phosphorylation

neutral loss 98 Da

glycosylation

162 Da loss
203 Da loss

acetylation

+42 Da mass shift

이러한 fragment는 PTM identification에 중요한 단서가 됩니다.

• Phosphorylation (인산화): CID 또는 HCD 모드 분석 시, 인산화된 펩타이드는 98 Da (H₃PO₄)가 떨어져 나가는 Neutral Loss 패턴이 매우 지배적으로 나타납니다.

• 이로 인해 상대적으로 b-ion이나 y-ion의 강도가 낮아져 서열 확인(Identification) 감도가 저하될 수 있으므로, 데이터 해석 시 이 점을 반드시 고려해야 합니다.

실전 MS/MS Spectrum 해석 순서

Proteomics MS/MS spectrum을 해석할 때 일반적으로 다음 순서를 따릅니다.

1️⃣ precursor m/z 확인
2️⃣ charge state 확인
3️⃣ y-ion ladder 확인
4️⃣ b-ion series 확인
5️⃣ fragment mass difference 계산
6️⃣ neutral loss 패턴 확인
7️⃣ PTM 가능성 확인

이 과정을 통해 peptide sequence를 결정할 수 있습니다.

Custom software interface for peptide mass calculation and PTM identification in proteomics. (Willy's LCMS 일부)

펩타이드 서열과 다양한 PTM을 조합하여 정확한 단편(Fragment) 질량을 예측하는 시뮬레이션 화면입니다. 아미노산의 고유 질량 값을 기반으로 시퀀싱 정확도를 극대화합니다.(Willy's LCMS 로 생성하였습니다.)

Quick Reference Summary

Proteomics fragmentation 핵심 규칙

1. CID/HCD → b-ion / y-ion 생성
2. y-ion intensity가 더 강한 경우가 많다
3. fragment mass difference → amino acid 확인
4. neutral loss → residue 또는 PTM 힌트
5. immonium ion → 특정 residue 존재
6. charge state ↑ → fragmentation efficiency ↑

---

LC-MS/MS proteomics 데이터 해석에서 peptide fragmentation 규칙을 이해하는 것은 매우 중요합니다.

특히 다음 세 가지 요소가 peptide identification의 핵심입니다.

• fragment ion series

• fragment mass difference

• neutral loss pattern

이러한 fragmentation 규칙을 이해하면 MS/MS spectrum 해석 속도와 정확도를 크게 향상시킬 수 있습니다.

👉 LC-MS/MS 전체 가이드 보기

관련 글 더 보기

• Charge State Determination from Isotope Spacing
• LC-MS/MS 데이터 해석 
• What Makes a Good MS/MS Spectrum for Peptide Identification
• LC-MS/MS Fragmentation 비교: CID vs HCD vs ETD 가이드 

•