LC-MS/MS에서 b-ion / y-ion Fragmentation 메커니즘

Proteomics 데이터 해석의 핵심 원리

단백질 기반 질량분석(proteomics)에서 LC-MS/MS 분석의 핵심 목적은 펩타이드 서열을 식별하는 것입니다.
이를 위해 MS/MS 단계에서는 선택된 precursor peptide가 충돌에 의해 분해되며, 이 과정에서 생성되는 fragment ion 패턴을 이용하여 아미노산 서열을 추론하게 됩니다.
펩타이드 fragmentation에서 가장 중요한 두 가지 fragment ion series는 b-ion과 y-ion입니다.
이 두 ion series는 proteomics 데이터 해석에서 사실상 서열 정보를 제공하는 핵심 신호라고 할 수 있습니다.

펩타이드 결합 구조와 fragmentation 위치

펩타이드는 아미노산이 peptide bond (–CO–NH–) 로 연결된 선형 분자입니다.

N-terminus

AA1 — AA2 — AA3 — AA4 — AA5 — AA6

C-terminus

MS/MS fragmentation은 주로 peptide bond 주변에서 발생합니다.
충돌 유도 분해(CID, HCD 등) 과정에서 peptide bond가 끊어지면서 여러 종류의 fragment ion이 생성됩니다.
대표적인 fragment ion 종류는 다음과 같습니다.
그러나 실제 proteomics 분석에서 가장 많이 사용되는 fragment ion은 b-ion과 y-ion입니다.


N-terminus

Ion series	방향
a-ion	N-terminal fragment
b-ion	N-terminal fragment
c-ion	N-terminal fragment
x-ion	C-terminal fragment
y-ion	C-terminal fragment
z-ion	C-terminal fragment

b-ion series

b-ion은 N-terminal 방향에서 생성되는 fragment ion입니다.

예를 들어 다음과 같은 펩타이드가 있다고 가정합니다.


PEPTIDE

fragmentation이 일어나면 다음과 같은 b-ion들이 생성됩니다.

Ion	포함된 서열
b1	P
b2	PE
b3	PEP
b4	PEPT
b5	PEPTI

즉 N-terminal에서부터 아미노산이 하나씩 추가되는 fragment series가 생성됩니다.

b-ion의 질량은 다음과 같이 계산됩니다.


b-ion mass = fragment residue mass + proton

y-ion series

y-ion은 C-terminal 방향에서 생성되는 fragment ion입니다.

같은 펩타이드에서 생성되는 y-ion은 다음과 같습니다.

Ion	포함된 서열
y1	E
y2	DE
y3	IDE
y4	TIDE
y5	PTIDE

즉 C-terminal에서부터 서열이 확장되는 fragment series입니다.

y-ion 질량 계산은 다음과 같습니다.


y-ion mass = fragment residue mass + H2O + proton

여기서 H₂O가 포함되는 이유는 C-terminal fragment가 carboxyl group을 포함하기 때문입니다.

MS/MS 스펙트럼에서의 b/y ion 패턴

MS/MS 스펙트럼에서는 b-ion과 y-ion이 다음과 같은 형태로 나타납니다.


Intensity
|
|        y5
|  b3
|      y4
| b2
|          y3
| b1
|
+--------------------------------
               m/z

fragment ion 사이의 m/z 차이는 특정 아미노산 residue 질량과 일치합니다.

예를 들어

Amino acid	Residue mass
Gly	57.02
Ala	71.04
Ser	87.03
Pro	97.05
Val	99.07

따라서 두 fragment 사이의 질량 차이를 통해 아미노산 서열을 유추할 수 있습니다.

Sequence tag 개념

fragment ion 사이에서 연속적인 residue mass 차이가 발견되면 이를 sequence tag라고 합니다.
예를 들어 다음과 같은 fragment가 있다고 가정합니다.
m/z difference = 99 → Valine
m/z difference = 57 → Glycine
이 경우 다음과 같은 sequence tag를 얻을 수 있습니다.
sequence tag는 database search에서 매우 강력한 단서가 됩니다.


m/z difference = 71 → Alanine

AVG

Neutral loss fragment

펩타이드 fragmentation에서는 종종 neutral loss fragment도 함께 관찰됩니다.
대표적인 neutral loss는 다음과 같습니다.
특히 다음 아미노산에서 자주 발생합니다.
Ser
Thr
Asp
Glu
Lys
Arg
이러한 neutral loss fragment는 스펙트럼을 복잡하게 만들 수 있지만, 동시에 특정 아미노산 존재를 암시하는 힌트가 되기도 합니다.

Neutral loss	질량
H₂O loss	−18 Da
NH₃ loss	−17 Da

PTM이 fragment pattern에 미치는 영향

펩타이드가 Post-Translational Modification (PTM) 을 포함하는 경우 fragment 질량도 함께 변화합니다.

예를 들어

PTM	Mass shift
Oxidation	+15.9949
Phosphorylation	+79.966
Carbamidomethylation	+57.021

PTM이 포함된 residue 이후의 fragment ion에서는 이러한 질량 변화가 반영됩니다.
따라서 PTM을 고려한 fragment 계산은 펩타이드 검증 과정에서 매우 중요합니다.

Proteomics 데이터 해석에서 b/y ion의 의미

MS/MS 스펙트럼에서 다음 조건이 만족될수록 펩타이드 서열 매칭의 신뢰도가 높아집니다.

연속적인 b-ion series 존재연속적인
y-ion series 존재
fragment mass error가 작음
precursor mass와 peptide mass가 일치

이러한 조건을 기반으로 proteomics 데이터베이스 검색 엔진(Mascot, Sequest, MS-GF+)은 펩타이드 서열을 식별하게 됩니다.

(차트는 Willys LCMS 에서 생성하였습니다)

b-ion과 y-ion fragmentation은 proteomics 질량분석 데이터 해석의 가장 중요한 원리입니다.

MS/MS 스펙트럼에서 나타나는 fragment ion 패턴을 통해 다음 정보를 얻을 수 있습니다.

펩타이드 아미노산 서열
sequence tag
PTM 존재 여부
데이터베이스 매칭 검증

b-ion / y-ion fragmentation 메커니즘을 이해하는 것은 LC-MS/MS 기반 proteomics 분석의 핵심 기초 라고 할 수 있습니다.